J Neuroinflammation︱武庆平课题组揭示神经病理性疼痛的持续神经元敏感化和神经炎性的重要机制
撰文︱许珍珍
责编︱王思珍
编辑︱杨彬伟
解剖学研究证实，痛觉是由周围感觉神经中的伤害性神经元激活产生的伤害性信号产生的。随后，伤害性信号通过背根神经节（DRG）神经元传递，经过DRG神经元与脊髓背角（SDH）神经元突触，最后投射到丘脑和大脑皮层。神经病理性疼痛是一种临床常见的慢性顽固性疼痛综合征，全球发病率约为7-10%。神经病理性疼痛的发病机制复杂，分子机制不明，阻碍了其临床治疗。越来越多的证据表明雌激素在外周和中枢神经系统中的关键作用[1]。雌激素以神经元为靶标，调节神经发育、可塑性，以及行为和认知功能中的神经保护作用[2]。雌激素通过其受体发挥作用，受体广泛分布于神经系统。然而，对于雌激素受体（ER）的作用的研究是有限的，雌激素受体可能在外周疼痛传导中起关键作用[3]。本研究前期结果表明，雌激素三种主要的受体GPER（雌激素G蛋白膜受体）、ERα和ERβ（两种核受体）主要在与疼痛相关的DRG中小型神经元中表达。目前尚不清楚调节ERs是否代表了神经病理性疼痛的有效治疗策略。
近日，武汉协和医院麻醉科的武庆平教授团队在Journal of Neuroinflammation上发表了题为“Positive interaction between GPER and β-alanine in the dorsal root ganglion uncovers potential mechanisms: mediating continuous neuronal sensitization and neuroinflammation responses in neuropathic pain”的文章，阐述了激活背根神经节（DRG）中GPER可诱导β-丙氨酸与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-1β和IL-6的表达呈正相关，并抑制参与SNI后神经病理性疼痛发展的GABAAα2（γ-氨基丁酸亚基α2）。GPER和β-丙氨酸的正相互作用以及随后β-丙氨酸的积累增强了痛感，促进了慢性疼痛的发展。
许多研究已经证明了了GABAAα2介导的神经病理性疼痛的镇痛作用，因为GABAAα2的缺失是伴随神经炎症的典型神经病理性疼痛表现[4, 5]。坐骨神经损伤模型（SNI）是最公认的模拟神经病理性疼痛的方法。许多关于神经性疼痛的发病机制、预防和治疗的研究表明，痛阈值是具有性别差异的[6]。值得注意的是，雌激素受体存在于DRG和SDH中。很少有研究聚焦于雌激素或雌激素受体通过离子通道调节疼痛。GPER是一种潜在的17β-雌激素靶点，参与雌激素对乳腺癌细胞中的调节[7]。此外，雌二醇通过减少GABAA在抑制性突触的停留时间来调节突触抑制的效果[8]；然而，涉及的受体尚不清楚。没有研究集中在雌激素受体在神经病理性疼痛的持续神经元敏化和神经炎症反应中的作用。本研究旨在确定神经病理性疼痛中的主要雌激素受体，并研究其相关的基因组学和代谢组学，多组学分析以探讨雌激素受体相关代谢物在神经病理性疼痛中的作用：具体地说，作者的目的是研究ERs（雌激素受体）在疼痛中的代谢机制，并阐明雌激素受体与神经元敏感性和神经炎症的潜在关系。
图1 雌激素受体在背根神经节和脊髓的分布和表达
（图源：Xu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022 ）
为了确定ERs在DRG神经元和SDH疼痛相关区域中的表达和功能，作者初步用免疫荧光双标记法研究了ERs在DRG神经元中的表达。首先免疫荧光双标记法显示ERs与IB4（标记C型非肽能神经元）、CGRP（标记C型肽能神经元）和NF-200（标记A型神经元）共存。其次通过计算IB4、CGRP和NF-200阳性神经元占ER阳性细胞的百分比（每组n=6）表明ERs主要分布在背根节的Aδ、C型神经元中（图1B）。IB4、CGRP和NF200所标记的神经元直径范围分别约为30.8、18.75 和42.75（每组n=10）（图1C）。雌激素受体主要在中/小型DRG神经元表达，但也有较大的DRG神经元表达。在获得DRG组织后（图1, 1D），用CGRP标记脊髓背角疼痛相关区域，发现该区域有三种雌激素受体表达（图1E）。以上证据整体表明雌激素受体在痛觉相关细胞和区域的表达提示雌激素受体可能参与痛觉等浅层感觉的调节。
图2 GPER的特异性阻断剂G15通过调节α2-GABAA参与神经病理性疼痛
（图源：Xu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022 ）
为了评价GPER在神经病理性疼痛中的作用，作者在SNI后第5天鞘内注射G蛋白偶联雌激素受体（GPER）的特异性拮抗剂G15。在注射G15（1.8 μg/μl，1 μl）的大鼠中，SNI+G15组可部分逆转SNI所致的冷觉和机械性痛觉过敏，并持续至行为学测试后8-20小时（p<0.001），PWCD（冷缩足潜伏期）从0 h 21.611到8h 6.453再到20h 6.620（p<0.001)。雌激素受体-α拮抗剂MPP（1 ng/μl，1μl）和雌激素受体-β拮抗剂PHTPP（1 ng/μl，1μl）不影响PWMT和PWCD（图2A&B）。在DRG中，α2-GABAA在坐骨神经损伤所致神经病理性疼痛的病理生理过程中起着重要作用。通过检测GABAA亚基的mRNA表达（图2C），其表达水平与免疫印迹结果一致，表明GPER通过调节GABAAα2参与神经病理性疼痛（p<0.001）（图2F）。SNI后GPER和ERα蛋白和α的表达均上调，SNI诱导的GABAα-2丢失在G15给药后恢复(图2D-F）。这些结果表明，GPER可能通过α-2-GABAA参与痛觉等浅表感觉的调节。双重免疫荧光染色显示，GPER和α2-GABAA共同定位于背根神经节神经元（图2G）。α2-GABAA已被证明在神经病理性疼痛中起重要作用，进一步表明GPER参与了疼痛的调节。
图3 代谢组学测试表明，β-丙氨酸诱导GPER上调
（图源：Xu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022 ）
根据基因组学结果，靶向代谢组学检测到300多种代谢物，发现14种物质在组间表现出差异，包括β-丙氨酸、氨基己酸、1H-吲哚-3-乙酰胺、烟酸、氨基己二酸、N-乙酰谷氨酰胺、乙酸、α-羟基异丁酸、甲基琥珀酸、石胆酸、L-肉碱、2,2-二甲基二酸、2,2-二甲基丁二酸（图3A&B）。假手术组与SNI组比较，SNI组与SNI+G15组比较。显示变化的物质包括β-丙氨酸和烟酸（图4C）。作者对涉及疼痛和炎症反应的通路特别感兴趣，因为这些通路可能参与介导SNI模型大鼠的神经炎症和疼痛机制。因此，作者继续对与炎症过程相关的代谢物进行PPI分析，KEGG分析表明，β-丙氨酸可能是导致GPER增加的一个关键因素（图4D, E）。
图4 GPER和β-丙氨酸的增加导致背根神经节神经元兴奋性的增强，类似于SNI
（图源：Xu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022 ）
膜片钳技术证实，GPER和β-丙氨酸的增加导致DRG神经元兴奋性的增强，类似于SNI（图4），揭示了神经病理性慢性疼痛的发病机制。
图5 β-丙氨酸在体外背根神经节神经元和小胶质细胞上与GPER结合
（图源：Xu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022 ）
温度梯度结合实验表明，在β-丙氨酸处理的DRG组织中，蛋白降解曲线右移，说明β-丙氨酸能够与GPER结合，从而提高GPER的稳定性，使其降解速度减慢（图5A）。双重免疫荧光染色显示，GPER与神经元和小胶质细胞共存，但不与星形胶质细胞共存（图5B）。与SNI组相比，SNI+G15组GPER下调（图5C）。为了确定作用的位置，作者提取了DRG的神经元和小胶质细胞，并用外源β-丙氨酸刺激在体内诱导了类似的iNOS、IL-1β、IL-6和GABAAα-2蛋白水平的变化（图5D）。GPER-siRNA转染后GPER蛋白表达水平降低，但外源β-丙氨酸刺激后上述变化不明显（图5E, F）。DRG神经元和小胶质细胞中GPER的激活导致β-丙氨酸与iNOS、IL-1β和IL-6的激活呈正相关，并抑制参与SNI后神经病理性疼痛和神经炎症发展的GABAAα2的表达。
图6工作总结图：GPER/β-丙氨酸在调节神经病理性疼痛中介导神经元敏化和神经炎症的机制图
（图源：Xu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022 ）
原文链接：https://jneuroinflammation.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12974-022-02524-9
共同第一作者许珍珍（前排左）和谢婉丽（前排右）；通讯作者武庆平教授（前排中）
（照片提供自：华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科武庆平教授团队）
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参考文献（上下滑动阅读）
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本文完